Kokryształy ezetymibu: przełom w zwiększaniu biodostępności

Czy kokrystalizacja może przełamać barierę rozpuszczalności ezetymibu?

Kokryształy ezetymibu z kwasem benzoesowym zwiększają rozpuszczalność leku 64-krotnie i poprawiają jego biodostępność 3–4-krotnie – wykazało badanie eksperymentalne prowadzone przez zespół z Mokpo National University. To przełomowe odkrycie dla farmacji, ponieważ ezetymib, lek hipolipemizujący z klasy BCS II, od lat boryka się z problemem niskiej biodostępności wynikającej z hydrofobowości cząsteczki. Naukowcy opublikowali wyniki w czasopiśmie Pharmaceutics, przedstawiając kompleksową analizę właściwości fizykochemicznych i farmakokinetycznych nowych form krystalicznych.

Badanie miało na celu identyfikację optymalnych koformerów dla ezetymibu, opracowanie stabilnych kokryształów oraz ocenę ich właściwości w warunkach in vitro i in vivo. Zespół badawczy porównał trzy kwasy organiczne – benzoesowy, winowy i bursztynowy – jako potencjalne kofomery, stosując dwie metody preparatyki: odparowanie rozpuszczalnika (SEV) oraz precypitację rozpuszczalnik/antyrozpuszczalnik (SAS).

Jak naukowcy projektowali i testowali nowe kokryształy?

W fazie przygotowawczej autorzy syntetyzowali kokryształy łącząc ezetymib z trzema koformerami w różnych stosunkach molowych (1:0,5, 1:1, 1:2). Metoda SEV polegała na rozpuszczeniu składników w octanie etylu w temperaturze 70°C, następnie suszeniu w 30°C przez 7 dni. Metoda SAS wykorzystywała metanol jako rozpuszczalnik i wodę jako antyrozpuszczalnik, z kroplowym dodawaniem przy 25°C i mieszaniu 300 rpm.

Charakterystykę fizykochemiczną przeprowadzono przy użyciu zaawansowanych technik analitycznych. Dyfrakcja rentgenowska proszku (PXRD) potwierdziła powstanie nowych faz krystalicznych – kokryształy EBA wykazały charakterystyczne piki przy 12,4°, 16,7° i 24,9°, nieobecne w widmach czystego API i koformera. Analiza DSC ujawniła istotne przesunięcia temperatury topnienia: dla EBA ΔTm wynosił -50°C względem API, co sugerowało utworzenie nowej struktury krystalicznej. Spektroskopia FTIR wykazała charakterystyczne zmiany w pasmach O-H (3264→3224 cm⁻¹), C=O (1726→1712 cm⁻¹) oraz C-F (1212→1219 cm⁻¹), potwierdzając tworzenie wiązań wodorowych między cząsteczkami.

Kluczowym elementem badania była analiza monokryształów metodą SCXRD, która ujawniła szczegółową architekturę molekularną. Kokryształ EBA krystalizował w układzie jednoskośnym (grupa przestrzenna P2₁/n) z parametrami sieci: a=5,42 Å, b=5,05 Å, c=21,61 Å, β=95,95°. Natomiast kokryształy z kwasem winowym (ETA) i bursztynowym (ESA) przyjmowały układ rombowy (grupa P212121) z podobnymi parametrami sieciowymi. Ta różnica w geometrii sieci krystalicznej miała bezpośrednie przełożenie na właściwości rozpuszczalności i stabilności preparatów.

Jakie wyniki przyniosły testy rozpuszczalności i uwalniania?

Badania rozpuszczalności prowadzono w czterech różnych układach surfaktantowych: 0,5% SLS, 0,5% PEG 8000, 0,5% Transcutol HP oraz 0,1% CTAB. Kokryształy EBA wykazały najwyższą rozpuszczalność we wszystkich testowanych mediach, osiągając 64-krotny wzrost w porównaniu z czystym ezetymibem. Dla porównania, kokryształy z kwasem winowym (ETA) dały 3–13-krotną poprawę, a z kwasem bursztynowym (ESA) jedynie 3-krotną. Autorzy przypisują te różnice obniżonej względnej energii swobodnej solwatacji oraz zróżnicowanym temperaturom topnienia koformerów: kwas benzoesowy (123°C) < ezetymib (162°C) < kwas winowy (172°C) < kwas bursztynowy (188°C).

Profile uwalniania in vitro testowano w medium biorelewantnym zawierającym 0,45% SLS w buforze octanowym (pH 4,5) przez 120 minut. Preparaty M2EBA1_2 (metoda SAS, stosunek 1:2) osiągnęły stężenie 0,22 mg/mL, co odpowiadało 89% uwolnienia substancji czynnej, podczas gdy czysty ezetymib uwalniał jedynie 45% w tym samym czasie (p<0,05). Kokryształy M1EBA1_2 (metoda SEV) wykazały nieco wolniejsze uwalnianie – 22% po 15 minutach w porównaniu z 45% dla preparatów SAS – co autorzy wiążą z różnicami w wielkości cząstek (50–100 μm dla SEV vs 5–20 μm dla SAS).

“Nasze wyniki sugerują, że wczesne zastosowanie kokrystalizacji z kwasem benzoesowym może znacząco poprawić wyniki terapii lekami o niskiej rozpuszczalności” – piszą autorzy badania, podkreślając uniwersalność tej strategii dla substancji z klasy BCS II.

Jak metoda syntezy wpływa na strukturę kokryształów?

Analiza mikroskopowa i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) ujawniły fundamentalne różnice morfologiczne między metodami preparatyki. Kokryształy otrzymane metodą SEV charakteryzowały się większymi, bardziej regularnymi kryształami o średnicy 50–100 μm, podczas gdy metoda SAS prowadziła do powstania mniejszych, nieregularnych cząstek o wymiarach 5–20 μm. Ta różnica wynika z kinetyki krystalizacji – wolne odparowanie rozpuszczalnika w metodzie SEV umożliwia stabilny wzrost kryształów i lepszą krystaliczność, natomiast szybkie przesycenie w metodzie SAS ogranicza czas formowania sieci krystalicznej.

Autorzy podkreślają, że wielkość cząstek ma bezpośredni wpływ na szybkość rozpuszczania – mniejsze cząstki z metody SAS wykazują szybsze początkowe uwalnianie (45% po 15 min), ale paradoksalnie nie zawsze przekłada się to na lepszą biodostępność in vivo. W niektórych przypadkach zaobserwowano, że zbyt szybkie rozpuszczanie może prowadzić do lokalnego przesycenia i ponownej krystalizacji API w przewodzie pokarmowym, co ogranicza absorpcję. Optymalny kompromis między szybkością rozpuszczania a stabilnością termodynamiczną osiągnięto dla preparatów SEV w stosunku 1:2, które łączyły umiarkowaną wielkość cząstek z wysoką krystalicznością.

Czy poprawa rozpuszczalności przekłada się na biodostępność?

Ocenę farmakokinetyczną przeprowadzono na samcach szczurów Sprague Dawley (n=4/grupa, masa ciała ~271 g) po jednorazowym podaniu doustnym. Cztery grupy otrzymały różne formulacje: CRYS101 (czysty ezetymib, 10 mg/kg), CRYS102 (kokryształ ezetymib/kwas benzoesowy 1:2, 30 mg/kg), CRYS103 (M1EBA1_2 SEV, 30 mg/kg) oraz CRYS104 (M2EBA1_2 SAS, 30 mg/kg). Próbki krwi pobierano z tętnicy udowej w określonych punktach czasowych, a oznaczenia wykonano metodą UPLC-MS/MS z dolną granicą oznaczalności 1 ng/mL (dokładność 88–103%, precyzja CV≤9,8%).

Kokryształy EBA (SEV, stosunek 1:2) przy dawce 30 mg/kg wykazały Cmax 3-krotnie wyższy i AUC 4-krotnie wyższy w porównaniu z czystym ezetymibem (p<0,05). Interesujące jest opóźnienie czasu osiągnięcia maksymalnego stężenia – Tmax wynosił 2,83±2,75 h dla kokryształów vs 1,33±0,76 h dla czystego API. Autorzy wiążą to z przedłużoną retencją żołądkową wynikającą ze stabilności sieci krystalicznej P2₁/n, co koreluje z danymi in vitro pokazującymi stopniowe uwalnianie (89% po 120 min).

Kluczowym problemem okazała się zależność absorpcji od dawki. Przy dawce 10 mg/kg aż 43,75% próbek było poniżej granicy oznaczalności (BQL), co sugeruje suboptymalną biodostępność przy niskich dawkach. Prawdopodobnie szybkie rozpuszczanie przekracza zdolność absorpcyjną jelita i prowadzi do rekrystalizacji API lub sekwestracji przez kwasy żółciowe. Paradoksalnie, niektóre osobniki otrzymujące 30 mg/kg wykazywały ekspozycję niższą niż przy dawce 10 mg/kg, co wskazuje na złożone interakcje między szybkością rozpuszczania, wielkością cząstek a fizjologią przewodu pokarmowego.

Dlaczego stosunek molowy 1:1 jest kluczowy dla stabilności?

Autorzy szczegółowo analizują wpływ stechiometrii na stabilność kokryształów, konstruując diagramy fazowe przy użyciu programu COSMO quick. Stosunek molowy API:koformer 1:1 maksymalizuje stabilność poprzez zrównoważone wiązania wodorowe i optymalne upakowanie w sieci krystalicznej. Odchylenia od tego stosunku prowadzą do powstawania układów dwufazowych lub hydratów – nadmiar API skutkuje współistnieniem kokryształu z niereagującym API (wykrywalnym w PXRD), natomiast nadmiar kofomera destabilizuje sieć krystaliczną, promując tworzenie solwatów lub hydratów.

Walidację eksperymentalną przeprowadzono porównując temperatury topnienia mierzone metodą DSC z przewidywaniami teoretycznymi opartymi na uproszczonym równaniu Schrödera-van Laara. Dla układów EBA i ESA przewidywane Tm były konsekwentnie niższe od wartości eksperymentalnych we wszystkich stosunkach molowych, potwierdzając udaną kokrystalizację. Jednak w układach ETA zaobserwowano małe odchylenia dla metody SEV (stosunki 1:0,5 i 1:1) oraz SAS (1:0,5), co wymaga rygorystycznej kontroli procesu podczas preparatyki.

Diagramy fazowe (reprezentowane jako trójkąty równoboczne) pokazały najszersze spektrum tworzenia kokryształów dla kwasu benzoesowego, następnie winowego, a najmniejsze dla bursztynowego. Ta hierarchia koreluje bezpośrednio z wynikami rozpuszczalności i uwalniania, sugerując, że łatwość formowania kokryształów przekłada się na ich właściwości biofarmaceutyczne. Potwierdzenie struktury uzyskano metodą SCXRD, która zidentyfikowała jednoskośne (EBA) i rombowe (ETA, ESA) układy krystaliczne charakterystyczne dla stabilnych kokryształów.

Jakie są perspektywy klinicznego zastosowania kokryształów?

Wyniki tego badania pozycjonują kokrystalizację z kwasem benzoesowym jako realną strategię dla leków z klasy BCS II, ale podkreślają konieczność zintegrowanego projektowania cząstek, optymalizacji dawki i modelowania rozpuszczania w warunkach biorelevantnych. Dla ezetymibu – leku stosowanego w leczeniu i prewencji miażdżycy poprzez hamowanie absorpcji cholesterolu w jelicie cienkim – 3–4-krotna poprawa biodostępności może mieć istotne znaczenie kliniczne, potencjalnie umożliwiając redukcję dawki lub poprawę skuteczności terapeutycznej u pacjentów z hiperlipidemią.

Autorzy wskazują jednak na kilka wyzwań translacyjnych. Po pierwsze, częste występowanie wyników BQL w badaniach in vivo (mimo spełnienia kryteriów walidacji metody: R²=0,995, dokładność 88–103%) sugeruje, że dolna granica oznaczalności 1 ng/mL może być niewystarczająca dla badań przedklinicznych – konieczne jest zwiększenie dawki lub poprawa czułości analitycznej. Po drugie, paradoksalne profile ekspozycji (niektóre osobniki przy 30 mg/kg miały niższą ekspozycję niż przy 10 mg/kg) wskazują na złożone interakcje między szybkością rozpuszczania a fizjologią absorpcji.

Produkcja kokryształów metodą SAS, celująca w zakres wielkości cząstek 50–100 μm, mogłaby zrównoważyć szybkość rozpuszczania i zapobiec precypitacji przesyconego roztworu. Kluczowe będzie również zapewnienie stabilności preparatu w warunkach wilgotnościowych – nadmiar kofomera w środowisku higroskopijnym może promować tworzenie hydratów poprzez hydrofilowe domeny, zmieniając właściwości mechaniczne i przyspieszając degradację pod wpływem stresu. Odchylenia od stechiometrii 1:1 wymagają rygorystycznej kontroli procesu podczas krystalizacji, zgodnie z wytycznymi ICH dotyczącymi badań stabilności.

Co to przełomowe badanie oznacza dla farmakoterapii?

Badanie po raz pierwszy wykazało, że kokryształy ezetymibu z kwasem benzoesowym (stosunek 1:2, metoda SEV) zapewniają 64-krotny wzrost rozpuszczalności, 2-krotną poprawę profilu uwalniania oraz 3–4-krotny wzrost biodostępności w porównaniu z czystym API. Analiza wielotechnikowa (DSC, FTIR, PXRD, SCXRD) potwierdziła powstanie nowych faz krystalicznych o układzie jednoskośnym P2₁/n dla EBA oraz rombowym P212121 dla ETA i ESA, z charakterystycznymi przesunięciami termicznymi i spektroskopowymi wskazującymi na tworzenie wiązań wodorowych. Badania farmakokinetyczne u szczurów wykazały zależność absorpcji od dawki, z optymalną biodostępnością przy 30 mg/kg, choć paradoksalne profile ekspozycji u niektórych osobników sugerują złożone interakcje między szybkością rozpuszczania a fizjologią jelita. Odkrycia te pozycjonują kokrystalizację jako racjonalną strategię formulacyjną dla przełamania bariery rozpuszczalności w lekach klasy BCS II, z potencjałem translacji klinicznej dla pacjentów z hiperlipidemią wymagających skuteczniejszej terapii hipolipemizującej, pod warunkiem optymalizacji wielkości cząstek, kontroli stechiometrii i zapewnienia stabilności preparatu.